チュートリアル 16：PCR 解析

PCR 解析コード（※）を利用して、ショウジョウバエ（Drosophila）の hsp70 遺伝子のプロモーター領域を増幅してみましょう。

1. Tutorials フォルダにある Hsp70 タンパク質ファイルを開きます。
   
   
   
2. DNA の下にある矢印は、このショウジョウバエの熱ショック遺伝子 (heat shock gene) に使われる実際の転写産物 (transcript) です。この転写産物の上流 300 nts の領域を選択して増幅することにしましょう。この部分に重要なプロモーター要素があると考えられるからです。矢印をダブルクリックしてそれに対応する DNA 断片を選択してください。コンストラクトウィンドウの左下には選択したヌクレオチド領域 1617-3677 が表示されます。
   
   
   
3. ウィンドウ表示をシークエンス・ビューに切り替えてください（Construct > Display > Display Sequence）。同一の領域が選択されているはずです。
   
   
   シークエンス番号 1616 の直前にある最初のヌクレオチドをマウスでクリックし、「上流」に向かってマウスをドラッグしてください。シークエンス番号 1317 付近までドラッグしたら、マウスのボタンを離します。
   
   
   シークエンスの開始点をシフトキーを押しながら選択すれば、選択範囲を正確に指定できます。ヌクレオチド領域が 1317-1616 になるまで操作を繰り返してみてください。領域を選択できたら、そのままの状態で、ウィンドウ表示をグラフィクス・ビューに切り替えます (Construct > Display > Display Graphics または Ctrl+/ )。
   
   
   
4. Tools メニューの PCR Analysis を選択して、PCR Analysis ダイアログを開いてください。
   
   
   以下のようなダイアログが開きます。Parameters リストにある項目のいずれかをクリックすると、ウィンドウの左側に選択した項目の詳細内容が表示されます。設定可能なパラメータにはどのようなものがあるか簡単に目を通してください。このうち「optional」と表示されているパラメータは、数値を入力しても、しなくても構いません。ここでは、5' と 3' の許容範囲をそれぞれ 75 に設定したら、Generate Primers ボタンを押します。
   
   
   
5. Generate Primers ボタンを押すと、以下のダイアログがあらわれます。元のパラメータで指定した条件に合うプライマー候補が５つ見つかりました。ウィンドウの下側には、リスト作成に際して、候補となるプライマー対がほかにどれだけあったかを示す統計データが表示されます。
   
   
   
6. リスト中央のプライマー対 (1293-1312, 1762-1781) を選択し、Add Primer ボタンを押してください。コンストラクトには複数のプライマーを追加することもできますが、ここで追加するのはこれだけにしておきます。プライマーを追加したら、Done ボタンを押してください。
   
   
   
7. 図のように 2つのプライマーが表示されているはずです。
   
   
   プライマーのいずれかをクリックすると、プライマー対を選択できます。プライマー対をクリックして、Command-I (Mac) または Control-I (Windows) を押すと、その情報を確認することができます。Construct メニューの Get Info を選択しても同様に確認できます。
   
   
   下図は、Get Info ウィンドウを表示させた例です。Get Info ウィンドウには、オリジナルのシークエンスから実際にどれだけのプライマーが作成されたのかを示す詳細な情報が表示されます。
   
   
   
8. プライマー対（プライマーのいずれでも可能）をダブルクリックすると、プライマー対によって増幅された DNA を選択できます。選択したシークエンスを別ウィンドウ（又は別アプリケーション）にコピーすれば、これを使って更に詳しく分析を進めることができます。